Techisun Magnetic Endo-free Plasmid Maxi Kit

磁珠法去内毒素质粒大量提取试剂盒

产品简介

Techisun Magnetic Endo-free Plasmid Maxi Kit采用超顺磁性磁珠纯化技术，配合专用内毒素去除液，可高效地从菌体中提取高纯度、低内毒素的质粒DNA。本试剂盒适用100– 200 mL过夜培养的大肠杆菌菌液，所得质粒DNA可直接用于酶切、PCR、一代测序及细胞转染等下游实验。

产品信息

货号	TN003-01	TN003-02
规格	10T	20T

储存条件

1. PartⅠ﹣25～﹣15℃ 保存，有效期18个月；
2. PartⅡ室温保存，有效期18个月。

注意事项：

1. Buffer P2 与 Buffer P3 均含有刺激性化学成分，操作时请务必穿着实验服，佩戴乳胶手套，避免试剂接触皮肤、眼睛和衣物，同时注意防止吸入气溶胶或飞沫。若不慎接触皮肤或眼睛，请立即用大量清水或生理盐水彻底冲洗；若刺激持续或加重，请及时就医。
2. 本产品仅供科研使用！

组分信息

类别	组分名称	规格（10T）	规格（20T）
PartⅠ	RNase A	5 mg/支×1	10 mg/支×1
PartⅡ	磁珠悬浮液	4 mL/瓶×1	8 mL/瓶×1
	Buffer P1	50 mL/瓶×1	100 mL/瓶×1
	Buffer P2	50 mL/瓶×1	100 mL/瓶×1
	Buffer P3	50 mL/瓶×1	100 mL/瓶×1
	内毒素去除液	15 mL/瓶×1	30 mL/瓶×1
	结合液	75 mL/瓶×1	75 mL/瓶×2
	Wash Buffer A	100 mL/瓶×1	100 mL/瓶×2
	Wash Buffer B	16 mL/瓶×2	24 mL/瓶×3
	洗脱液	10 mL/瓶×1	20 mL/瓶×1

实验前准备：

1. 自备仪器与试剂：台式离心机、磁力架、金属浴、小型离心机、涡旋振荡仪、无水乙醇。
2. 首次使用前，将RNase A全部加入到Buffer P1瓶中，充分混匀后使用，并做好标记，储存于2-8 ℃。
3. 按瓶身标签所示，Wash Buffer B（10T）每瓶加入64 mL无水乙醇稀释， Wash Buffer B（20T）每瓶加入96 mL无水乙醇稀释，并在标签的方框中打勾做好“乙醇已加”的标记。
4. 使用前请检查Buffer P2和Wash Buffer A是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请于37 ℃水浴重新溶解。

操作方法

一、手动提取

样本预处理：

1. 从新鲜制备的琼脂平板上挑取单个克隆菌落，接种至含有相应抗生素的 LB 液体培养基中，于37 ℃下剧烈振荡培养12–16小时。

注意：培养时间不宜超过16小时，否则细菌可能发生溶解，导致质粒DNA得率下降。培养基装液量不应超过培养容器容积的 1/4，以保证充分供氧。若使用长期保存的甘油菌，菌株可能发生遗传变异或出现质粒丢失的细胞，因此使用前须在含抗生素的平板上划线分离，挑取生长良好的单菌落进行接种培养。

 

2. 取100-200 mL 过夜培养的菌液到合适的离心管中，12,000 rpm 离心5 min，吸弃上清液，收集菌体沉淀。

 

3. 加入5 mL Buffer P1，吹打或涡旋重悬菌体沉淀。

注意：务必确保菌体彻底重悬，否则影响得率和质量。确保Buffer P1中已添加 RNase A。

 

4. 加入5 mL Buffer P2，立即温和地上下翻转10-20次以充分裂解菌体，室温放置1-2 min。

注意：使用 Buffer P2 前，请确认溶液中无沉淀析出；使用完毕后应立即盖紧瓶盖，避免长时间暴露于空气中。当裂解充分时，菌液应呈黏稠且透明的状态。若未达此状态，可能因菌量过多所致，可通过增加轻柔翻转的次数促进裂解，但该步骤总时间不得超过5 min。

裂解过程中严禁使用涡旋振荡器混匀，否则会导致最终质粒产物中混有基因组 DNA 污染。

 

5. 加入 5 mL Buffer P3，立即温和地上下翻转 10-20 次充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm 室温离心10 min。

注意：加入Buffer P3后应立即颠倒混匀，以防止沉淀团聚而影响中和效果。菌量较多时，可稍加用力颠倒数次至溶液彻底中和，中和后沉淀应为白色。

 

6. 转移上清至新的离心管中，加入 1/10 体积的内毒素去除液（如 600 µL 上清加入 60 µL 内毒素去除液）。颠倒混匀后置于 4℃冰箱冷藏15 min，取出后 42℃温浴15 min。

 

7. 12,000 rpm 离心5 min，取全部上层清夜到50 mL的离心管中，即得到样本处理液。

注意：此步离心后可观察到离心管内液体明显分层，小心吸取全部上层液体，注意不要吸到下层绿色液体。

 

8. 在样本处理液中加入0.5倍体积的结合液和400 µL磁珠悬浮液，振荡混匀7 min。

注意：磁珠悬浮液使用前需充分涡旋混匀，保证磁珠彻底重悬，每加样几次后需充分摇匀后继续加样。

 

9. 将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸弃上清。

 

10. 加入8 mL Wash Buffer A，振荡混匀3 min，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸弃上清。

 

11. 加入8 mL Wash Buffer B（确保已加入无水乙醇），振荡混匀2 min，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠附完全后，吸弃上清。

 

12. 加入8 mL Wash Buffer B（确保已加入无水乙醇），振荡混匀1 min，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸弃上清。

 

13. 将离心管敞口放置5-7 min，使无水乙醇充分挥发干净。

 

14. 将离心管从磁力架上取下，加入1 mL洗脱液，涡旋混匀。短暂离心，65℃孵育6 min，期间可涡旋混匀以提高洗脱效率。短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附，小心吸取上清到新的离心管中，即得到纯的质粒 DNA。

注意：不要吸到磁珠，否则影响质粒纯度。

Techisun Magnetic Endo-free Plasmid Maxi Kit采用超顺磁性磁珠纯化技术，配合专用内毒素去除液，可高效地从菌体中提取高纯度、低内毒素的质粒DNA。本试剂盒适用100– 200 mL过夜培养的大肠杆菌菌液，所得质粒DNA可直接用于酶切、PCR、一代测序及细胞转染等下游实验。