Animal Cells / Tissues / Bacterial Genomic DNA Extraction Kit

动物组织/细菌基因组DNA 提取试剂盒

产品简介

货号：TN005

本产品采用磁珠法，整个操作过程无需接触酚氯仿等有毒试剂，也无需进行耗时的醇类沉淀，并最大限度的去除RNA、杂蛋白、脂类及其他抑制性杂质。本试剂盒适合于从<25mg 动物组织、1~5 mL 细菌培养液(<3.0×10⁹个细菌中快速提取基因组DNA。纯化的DNA 可直接用于PCR、qPCR、酶切等。

产品组分

产品编号	TN005-01/50T	TN005-02/200T
Buffer ABL	12 ml	48 mL
Proteinase K*	1 ml	4 mL
Buffer WA	30 ml	120 mL
Buffer WB**	15 ml	30 mL×2
Elution Buffer	10 ml	40 mL
磁珠悬浮液***	1.1ml	1.1 mL×4支

 

需自备试剂：无水乙醇、异丙醇。

*Proteinase K：室温保存三个月，长期保存需置于-20~8°C，室温运输。

**Buffer WB 使用前，须按瓶子标签所示，加入无水乙醇稀释，于室温保存。

***磁珠悬浮液：2~8℃保存，使用前请充分混匀。

 

 

实验步骤（以下离心均在室温下进行）

一、样本处理

细胞样本

1、细胞总量不可超过5×10⁶个。300 ×g 离心5 min 收集细胞，弃上清液。
注：贴壁细胞：可采用细胞刮或洁净的枪头剥离，亦可先用胰酶对细胞进行消化，然后离心收集细胞。

2、依次加入200 μL Buffer ABL、20 μL Proteinase K，振荡混匀。
注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：加入200 μL Buffer ABL、10 μL RNase A(100 mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5 min，再加入20 μL Proteinase K，振荡混匀。

3、56°C水浴10 min，期间上下颠倒混匀数次。

组织样本

1. 取<25 mg剪碎或液氮研磨的组织（脾脏及肾脏小于10 mg）于1.5 mL 离心管中，依次加入200 μL Buffer ABL、20 μL Proteinase K，振荡混匀。
   注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：加入200μl Buffer ABL、10μl RNase A(100mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5min，再加入20μl Proteinase K，振荡混匀。

样本过量会降低DNA 产量和纯度。脾脏及肾脏等样本富含DNA，取样应小于10mg。肌肉和皮肤等样品DNA 含量低的组织，取样可扩大至25-50mg，同时按比例增加Buffer ABL、Proteinase K、Buffer DBL 和无水乙醇的用量。

2、56°C水浴至完全酶解，期间上下颠倒混匀数次，溶液中应无颗粒状沉淀。
注：组织块尽量剪碎或液氮研磨以缩短消化时间。消化时间取决于样本的类型和匀浆效果。一般组织样本需0.5-3h，鼠尾需6-8h 或过夜消化。若组织样本经液氮研磨成面粉状，可直接使用组织样本简易操作流程进行提取。

组织样本简易操作流程（液氮充分研磨成面粉状的组织样本可采用此流程）

1、取<25mg 液氮充分研磨成面粉状的组织（脾脏及肾脏小于10mg）于1.5 mL 离心管中，依次加入200 μL Buffer ABL、20 μL Proteinase K，振荡混匀，直至溶液中无颗粒状物质。
注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：加入200 μL Buffer ABL、10 μL RNase A(100 mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5min，再加入20 μL Proteinase K，振荡混匀。

细菌样本

a. 革兰氏阴性菌

1、取细菌培养液1-5 mL（<3.0×10⁹个细菌），12,000 rpm 离心1 min，弃去上清。
注：细菌数量可以通过分光光度计进行测量，OD₆₀₀=1.0时约为1.5×10⁹个/ mL。

2、依次加入300 μL Buffer ABL、10 μL RNaseA(100mg/ mL)、涡旋混匀1 min，静置5 min。再加入20 μL Proteinase K，涡旋混匀1 min，静置5 min。

b. 革兰氏阳性菌

1、取细菌培养液1-5 mL（<3.0×10⁹个细菌），12,000 rpm 离心1 min，弃培养液。
注：细菌数量可以通过分光光度计进行测量，OD600=1.0时约为1.5×10⁹个/ mL。

2、加入180 μL Lysozyme(20 mg/ mL)，振荡使菌体重悬，37°C水浴30 min。
注：1 大部分细菌水浴30min 后即可充分破壁，但某些细胞壁较厚的细菌（如金黄色葡萄球菌）需要处理1-2h 才能完全破壁。请根据不同类别的细菌，适当调整水浴时间。2 对于细胞壁特别厚的革兰氏阳性球菌，可按照复杂菌操作流程进行提取。

3、依次加入20μl Proteinase K，振荡混匀。
注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：在步骤2之后加入10μl RNase A(100mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5min，再加入20μl Proteinase K、200μl Buffer DBL，振荡混匀。

4、56°C水浴10min，期间上下颠倒混匀数次。

 

c. 复杂菌（细胞壁特别厚的革兰氏阳性球菌）

1、取细菌培养液1-5 mL（<3.0×10⁹个细菌），12,000rpm 离心1min，弃培养液。
注：细菌数量可以通过分光光度计进行测量，OD600=1.0时约为1.5×10⁹个细菌/ mL。

2、加入1 mL 70%乙醇震荡使菌体重悬后，冰浴20min，12,000rpm 离心1min，弃上清。

3、加入180μl Lysozyme，振荡使菌体重悬，37°C水浴至充分破壁。12,000rpm 离心1min，弃上清。
注：大部分细菌水浴30min 后即可充分破壁，但某些细胞壁特别厚的革兰氏阳性球菌需处理3h 才能完全破壁。请根据不同类别的细菌，适当调整水浴时间。

4、依次加入200μl Buffer ABL、20μl Proteinase K，振荡使菌体重悬。
注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：加入200μl Buffer ABL、10μl RNase A(100mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5-15min，再加入20μl Proteinase K，振荡混匀。

5、56°C水浴30min，期间上下颠倒混匀数次。

酵母

1、取酵母培养液（<5.0×10⁷细胞），12,000rpm 离心1min，弃上清液。

2、加入500μl 山梨醇Buffer（1M sorbitol，10mM EDTA，14mM β-mercaptoethanol）、15units lyticase，37°C水浴1h，5,000×g 离心10min，弃上清。

3、依次加入100μl Buffer ABL、20μl Proteinase K，振荡使菌体重悬。
注：若RNA 残留对后续实验影响较大，可选用此步骤：加入200μl Buffer ABL、10μl RNase A(100mg/ mL)（货号：TQ-YG-006），振荡混匀，瞬离后静置5-15min，再加入20μl Proteinase K，振荡混匀。

4、56°C水浴30min，期间上下颠倒混匀数次。

二、纯化

1、转移上清至新的1.5 mL离心管。

2、加入450μl 异丙醇与20μl 磁珠悬浮液（需充分混匀），涡旋1min，置于磁力架磁吸30s。待磁珠完全吸附，吸弃上清。

3、加入600μl Buffer WA，涡旋1min，置于磁力架磁吸30s。待磁珠完全吸附，弃上清。

4、加入600μl Buffer WB，涡旋1min，置于磁力架磁吸30s。待磁珠完全吸附，弃上清。

5、重复步骤4。

6、离心机瞬离收集管壁上的液滴，置于磁力架磁吸30s。待磁珠完全吸附，用移液枪吸尽残留液滴，开盖干燥5-8min（干燥时间过久会影响洗脱效率）。

7、加入50-100μl 洗脱液，涡旋混匀。65℃震荡孵育10min。置于磁力架磁吸30s。待磁珠完全吸附，将液体转移至收集管中，注意不要吸到磁珠。

8、核酸溶液短期保存于-20℃，长期保存与-80℃。

常见问题

1. DNA 产量低

50. 样本被反复冻融：避免反复冻融样本，推荐使用新鲜样本或只冻融过一次的样本。
50. 动物组织裂解不充分：组织块尽量剪碎或液氮研磨，提取时使样本及时与Buffer ABL 及Proteinase K 充分混匀，且可适当延长56°C水浴裂解时间。
50. 革兰氏阳性菌破壁不完全：可适量增加Lysozyme 的用量或延长其消化时间；或者按照复杂菌操作流程进行操作。
50. Proteinase K 活性下降：更换新的Proteinase K，使用后的Proteinase K 必须保存于2~8°C。
50. 未完全将裂解混合物转移至柱子中：细胞裂解后加无水乙醇，溶液中会出现絮状沉淀，需要将其同溶液一起转移至柱子中。
50. 洗脱液问题：请使用试剂盒自带的Elution Buffer 洗脱，若用ddH₂O 或其它洗脱液，确认洗脱液pH 值在8.0-9.0之间。可提前将Elution Buffer 预热至55°C后再进行洗脱，有利于提高DNA 得率。
50. Buffer WB 未添加无水乙醇：按瓶身标签所示，加入指定体积的无水乙醇至Buffer WB 中。

2. DNA 纯度低

50. 杂蛋白污染：未使用Buffer WA 漂洗。
50. 杂质离子污染：未使用Buffer WB 漂洗，或只漂洗一次。请按照说明书使用Buffer WB 漂洗两次。
50. RNA 残留：未在指定步骤加RNaseA，或RNaseA 孵育时间过短。请按照说明书指定步骤加入RNaseA，对于RNA 含量较多的样本，可适当延长孵育时间。
50. 乙醇残留：磁珠在洗脱前，未干燥去除乙醇。

保存条件

本产品可在室温下保存18个月。

Proteinase K 室温保存三个月，长期保存需置于-20~8°C，室温运输。

 

 

本产品采用磁珠法，整个操作过程无需接触酚氯仿等有毒试剂，也无需进行耗时的醇类沉淀，并最大限度的去除RNA、杂蛋白、脂类及其他抑制性杂质。本试剂盒适合于从<25mg 动物组织、1~5 mL 细菌培养液(<3.0×10⁹个细菌中快速提取基因组DNA。纯化的DNA 可直接用于PCR、qPCR、酶切等。